基于早期在免疫療法領域的研究和開發主要使用的是樹突狀細胞(DC)治療方法。樹突狀細胞(DC)通常被認為在抗原呈遞細胞(APC)中是功能性最強的細胞，且在連接先天性免疫系統和適應性免疫系統方面起著關鍵性作用[4,5]。為了以適當方式激活T細胞進行免疫攻擊，樹突狀細胞(DC)先對抗原進行加工隨后在其表面進行抗原的表達，其作用類似于公告牌。這種表達和活化的步驟經常會失去對癌細胞的識別，這就好比于當把癌細胞視為“自體”時，樹突狀細胞(DC)不能以適當方式處理這種信號。?

為了解決這一問題，很多研究人員已經開始研究通過培養單核細胞、分化出樹突狀細胞(DC)以及修飾樹突狀細胞(DC) 在自體外識別腫瘤信號。這樣在重新回輸活化的成熟樹突狀細胞(DC)時就會激活免疫系統(圖1)[6]。

盡管已有多個早期和晚期臨床試驗使用了這種方法，但目前美國只有一種基于樹突狀細胞的療法實現商業化[6]。

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圖1-基于樹突狀細胞治療的生產[9]。

Provenge?(Sipuleucel-T)于2010年由Dendreon實現商業化，目前仍用于晚期前列腺癌的治療[7]。近期市場報告預計，直到2030年“全球樹突狀細胞和腫瘤細胞癌疫苗”的年增長率可達20.7%[8]。

隨著人們越來越關注基于細胞類的藥物產品，為其生產選擇合適的系統和材料變得越來越重要。?

本文將重點介紹在選擇培養容器時需要考慮的材料特性和重要因素。除此之外，在決定和開發完整的生產工藝時需要考慮上游(如擴增)和下游(如采集)的加工培養步驟以及配套材料(如培養基和細胞因子)也非常關鍵[10-12]。

單核細胞到樹突細胞培養系統的現狀

使用一次性材料進行細胞培養可以追溯到20世紀60年代。最初先是從玻璃培養皿過渡到硬質塑料容器(T-Flask)，現在的培養系統則為硬質材料和軟塑料系統的動態混合，并且不斷演化發展出各種新材料的創新 [13]?

選擇細胞培養容器時需要考慮的關鍵材料特性- 透氧性和水蒸汽滲透性

很多因素會影響聚合物的滲透性，包括但不限于：

???? 滲透分子的大小/物理狀態

???? 聚合物的形態/性質

???? 滲透物的溶解度/擴散率

???? 是否存在填料、濕度和增塑劑?

在選擇封閉式培養系統時，包括水蒸汽在內的氣體滲透性堪稱最關鍵的特性。這是由于細胞需要依靠系統材料的滲透維持適當濃度的氧氣(和二氧化碳)并獲得足以限制蒸發的屏障 - 這些對于細胞的整體代謝功能至關重要。?

細胞培養通常需要使用加濕型培養箱減少細胞環境中的水分流失(圖2-4)。

圖2-細胞呼吸的高水平反應[14-16]。

圖3- 細胞呼吸的高水平反應

圖4- 靜態滲透性培養系統

透明度

透明度是一種用于描述光線透射材料能力的物理屬性?！肮饩€”根據波長的不同可以分為紫外線、可見光以及紅外光譜等。

特定波長透明度的優勢與相應應用有關。包括但不限于以下一些示例：

可見光透明度(400-700nm)

???? 光學顯微鏡成像

???? 培養狀態的目測檢查(如，污染情況或pH變化)

???? 熒光顯微鏡成像

UV-A透光性(320-400nm)

???? 光分離置換

???? 熒光顯微鏡成像

在上述操作中，透明的培養袋能夠避免進行取樣或更換器皿，其不但可以減少工作量以及培養環境操控，還可消除可能的污染。

可提取物和浸出物

可提取和浸出物是用于描述各種條件下遷移化合物的術語。

可提取物物

可在標準條件下從接觸表面遷移的有機和無機化學物質。標準條件可能包括：

???? 較高溫度

???? 較長接觸時間

???? 標準溶劑

可提取物在儲存和使用條件下可以浸入產品中[17]。

浸出物

在特定應用或“工況”條件下從接觸表面遷移的有機和無機化學物質[17]。

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這些通常被視為可提取物的一種，但并非所有浸出物均要通過典型的提取測試進行識別(圖5)。

圖5-可提取物與浸出物之間的關系。

由于浸出物與特定過程直接相關，因此不存在可供識別的通用測試。大多數情況下，采用多種溶劑的溶出測試以及足夠靈敏的分析工具可以用于表達遷移出的化合物。一些最常用的方法如表1所示.

表1- 常見的可提取物和浸出物分析方法概述[17]。

通常情況下，必須要能夠定量識別和確認可能從塑料裝置上遷移出的雜質并對細胞的生長和培養期間有潛在的風險和和負面影響的危害。Amgen 在2013年檢測到即使少量遷移化合物也會造成影響。當時，Amgen所研究的是聚烯烴中的常見抗氧化劑Irgafos?168對于幾種中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系生長的影響[18]。經過對各種方案的徹底調查之后，Amgen通過與供應商密切合作對原料中Irgafos的初始量進行優化，以此降低浸出化合物濃度，最終降低了這種不利影響[18]。?

除了對細胞培養的直接影響之外，另外還存在遷移出的化合物在藥物生產過程中污染下游工序的風險，尤其是在沒有最終過濾工序情況下生產細胞治療藥物工序時。

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總結

在選擇細胞培養所使用的系統時，諸如滲透性、透明性和可提取物等材料特性均至關重要。除此之外，選擇適當解決方案時還要考慮其他幾種材料和非材料特性。這些特性包括但不限于：

???? 封閉系統方案

???? 尺寸和形狀配置

???? 管件、端口和連接器類型

???? 無菌性和保質期

本報告后續章節將概要列出氟化乙烯丙烯(FEP)(一種常見培養材料)的特性以及培養數據，以便對于關鍵材料特性與細胞培養性能之間的關系有一個經驗上的把握。?

表2- FEP和EVA的透氧性

氟化乙烯丙烯的具體材料特性

FEP是一種經過完全氟化的含氟聚合物，其所具備的多種固有材料特性非常適合用于包括細胞培養在內的許多細胞療法應用。本節提供的FEP相關數據與上述細胞培養系統的關鍵特性一致。?

所給出的所有性能數據均基于針對5 mil(0.127mm)薄膜的測量，該厚度為FEP培養容器的常用厚度。在滲透性方面，為了確立對比參考點，還對細胞培養常用的乙烯醋酸乙烯酯(EVA)薄膜進行了測試。在此情況下，對8mil(0.203mm)薄膜進行了測量，該厚度為EVA培養容器的普通厚度。

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透氧性

依照ASTM D3985要求使用MOCON OxTran 220 OTR分析儀在25℃和37℃條件對氧氣透過率(OTR)進行測量(表3)。?

表3- FEP和EVA的水蒸汽滲透性。

FEP的透氧性可實現氧氣的大量滲透，足以滿足很多細胞培養過程中的代謝要求。

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水蒸汽滲透性

依照ASTM F1249要求使用MOCON Permatran W700水蒸氣分析儀對水蒸氣透過率(WVTR)進行測量(表3)。

盡管FEP可以滲透氧氣，但卻能夠有效阻擋水蒸氣，通常無需通過加濕，避免培養箱內的大量水分流失。這些從表4中的數據中即可看出。數據顯示了40°C非加濕烘箱中的六個注水FEP袋在14天內的平均水分流失情況。(表4).?

表4- FEP袋內的水分流失

可提取物

與大多數聚合物不同的是，FEP薄膜的擠出工藝不使用任何添加劑(如，抗氧化劑、增塑劑、加工助劑等)。作為經過完全氟化的聚合物，其具有極高的固有穩定性，且在水或其他溶劑中不會析出改性劑或其他物質。因此，可提取物通常達到或低于檢測限(表5)。

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表5- FEP內溶出物概況摘要

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測試結果基于兩個無菌2PF-0290 VueLife?FEP袋的匯總分析。以3cm2：1ml萃取比在70℃條件下在水或70％乙醇/30％水(容積百分比)中萃取24小時。

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透明度

使用PerkinElmer UV-Vis-NIR分光光度計上測量FEP光透射率。

FEP是透光性最高的塑料，透過其薄膜可以一覽無余。這對于形態學特征以及通過諸如酚紅等標志物展示細胞環境的劇烈變化至關重要(表6)

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表6- FEP的透明度特性

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利用FEP培養體系進行單核細胞到樹突狀細胞的培養和分化

方法

單核細胞富集

按照制造商的說明使用Elutra(Terumo)細胞處理系統。簡而言之，將補充1％HSA(CSL)的HBSS(Lonza)連接至培養基系，將0.9％氯化鈉(Baxter)連接至第二培養基系，將新鮮的志愿者單采血漿(Key Biologics，TN)連接到Elutra一次性試劑盒的樣品輸入管線上。?

Elutra分離方案根據制造商說明操作，如表7所示

表7- Elutra分離方案細節

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單核細胞培養/分化

將含有大部分單核細胞的組分以800×g離心5分鐘，并完全懸浮在CellGenix GMP DC培養基中(以500U/ml GM-CSF和500U / ml IL-4(均為CellGenix)進行補料)。將單位為100萬細胞/毫升的培養液轉移至VueLife?160-C1培養袋(圣戈班的產品)。通過搖動/倒置方式將袋中的產品充分混合，然后置于標準的加濕培養箱(37℃，5％CO)內7天。

第1、3、5和7天時將袋子從培養箱中取出，在倒置顯微鏡下觀察，并在充分混合后取出樣品。?

在第1天和第3天時，補充新鮮的樹突狀細胞培養基以確保取樣后體積沒有變化。在第5天時，向培養皿補充樹突狀細胞培養基以及另外500ng/ml腫瘤壞死因子α(TNFα)(CellGenix)。在第7天時，停止培養并收集細胞進行分析。

樹突狀細胞產量按相對單核細胞起始數量的百分比計算。

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分析

取樣后立即在Nova pHOx生化分析儀上測量酸堿平衡和呼吸參數(pCO2、pO2和pH)。

第二個樣品在解凍以及在Cedex生化分析儀(Roche)上進行乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺和銨分析之前進行冷凍。在AC* T DIFF?血液分析儀Beckman Coulter上進行全血細胞計數(CBC)。

細胞計數和存活率測量在Chemometec的NucleoCounter-200上進行，隨后在Gallios的BeckmanCoulter上對樣品進行流式細胞術(FACS)分析(表9)。

使用FlowJo軟件進行補償和分析。

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結論

細胞活性和產量

使用FEP袋進行培養獲得相當不錯的產量(60％)，圖5，左圖和活力(92％)，圖6，右圖為單核細胞到樹突狀細胞培養的預期值[19-21]。?

圖6- 利用VueLife培養袋進行樹突狀細胞分化實驗的細胞產量和細胞活力

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表8- FACS板的樹突狀細胞分析

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Tuyaerts等評審強調，基于單核細胞富集方法獲得的樹突狀細胞產量和純度變化很大，報告值分別為4-100％和1-20％[10]。經過篩選后，單核細胞的回收率和純度趨于約90％，盡管分化為樹突狀細胞的過程存在差異，Eyrich報告產量為47％，標準偏差32％[11]，Adamson報告為42％，標準偏差13％[12]。

化學分析

化學分析表明pH、pO2和pCO2水平在培養過程中均保持一致，并與環境保持平衡(圖7)。樹突培養基的pH值為7.2，并在整個培養過程中始終保持不變，突出展示培養袋特性可以確保培養期間的恒定pH。培養過程中乳酸和銨鹽有所增加，而兩者均為細胞代謝副產品，因此表明細胞代謝活躍。由于在培養期間沒有更換培養基，因此預計兩種代謝物的含量均會增加。作為細胞死亡測量指標的乳酸脫氫酶始終穩定，表明培養期間不存在與細胞死亡水平增加相關的有害作用。培養期間作為細胞代謝輸入物的葡萄糖水平降低，而隨著活性細胞對該試劑的消耗而減少，正如預期。谷氨酸鹽是一種氨基酸，是細胞生長所必需的。谷氨酸鹽的水平超出預計量的下降是因為培養基固有的不穩定性，并且與葡萄糖和總蛋白的下降一致，這些均表明存在活躍的細胞代謝。

其他化學物質(乳酸、銨、葡萄糖、谷氨酰胺、LDH和總蛋白)均在單核細胞到樹突狀細胞培養的預期值范圍內(圖8)。

圖7- 樹突細胞分化實驗的pH、pO2和pCO2測量

N=3。使用Nova pHOx生物分析儀對新鮮樣品進行測量。

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圖8- 樹突狀細胞分化實驗中的乳酸、葡萄糖、銨、谷氨酰胺、LDH和總蛋白測量。

N=3。使用Roche Cedex生化分析儀對冷凍樣品進行測量。?

表型分析

通過流式細胞儀進行的表型分析表明分化過程中細胞的大小和復雜性均有增加(前向和側向增加) (圖9)。到第7天時，CD14表達的敲除基本完成。培養期間觀察到與樹突狀細胞分化和成熟相關的標志物表達均有增加。在這些標志物中，CD86和HLA-DR表達在第0天初始單核細胞中成分較高，但在分化過程中仍然進一步增加。CD40、CD1a、CD80和CD83在第0天時基本上不存在，但在分化過程結束時顯著增加，并且CD1a和CD80變化幅度最大。?

總結

本文所做的研究表明，使用FEP袋進行單核細胞到樹突狀細胞培養和分化所產生的效果與使用其他器皿的值一致。產量(60％)和活力(92％)與先前報告的值相當?；瘜W分析表明，通過提供根據pO2、pCO和pH測量的大量氣體交換，FEP袋的特性能夠對細胞環境進行適當的控制。代謝物數據表明細胞存在活躍代謝，即細胞在FEP袋內處于健康狀態。細胞表型表明隨著時間變化，從第1天的較大的單核細胞群體(通過CD14標志物顯示)變為第7天的未成熟樹突狀細胞群體(CD14+敲除小于10％且CD40+，CD83+，CD86+和HLA-DR+大于75％)。?

結論

在選擇細胞培養容器時，除了傳統的“生物相容性”外，還需要考慮更多因素。

所需要的某些材料屬性在本文中概括如下：

???? 氣體和水蒸汽滲透性

???? 透明度

???? 溶出物特征

此外，在選擇成品培養容器時需要考慮多個方面。其中包括以下因素：

???? 該容器是否可視為密閉系統？

???? 存在哪些尺寸和形狀可供選用？

???? 有哪些管件、端口和連接器可供選用？

???? 產品如何消毒？

????????? 產品保質期如何？

根據關鍵材料特性，由FEP制成的VueLife?被確認為是單核細胞培養和分化的合適選擇。然而，鑒于細胞療法市場中的生產和細胞類型多樣性，很少有適用所有細胞培養過程一勞永逸的解決方案。為了確保材料的正確選型并根據特定生產需求完成設計，盡早與供應商展開討論非常重要。

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圖9- 7天培養期間從單核細胞向樹突狀細胞轉變過程中的細胞表型

?A)???? 根據第0天頂部、第5天中部和第7天底部在培養期內尺寸和復雜性增加的前向和側向對比，初始產物擁有12％粒細胞，數據未顯示。

B)???? CD40、CD1a、CD80和CD83中的表達增加，同時CD86和HLA-DR表達不變。隨著時間的推移，群體失去CD14+CD66b

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